类器官（Organoids）是由干细胞或多能干细胞培养分化而形成的三维结构，能够在一定程度上模拟真实器官的结构和功能。判断类器官是否成熟并且在适当的时候进行传代是确保类器官实验能够正常进行的关键，今天我们就给大家分享下如何判断类器官是否成熟以及类器官的传代流程。

一. 判断类器官成熟的标志 

1 形态学观察

大小和形状：成熟的类器官通常大小均匀，形状规则。不同类器官的形态特征不同，例如肠道类器官通常呈现囊状结构，而脑类器官可能呈现神经球状结构。

正常人体肠道类器官培养不同天数的形态，通常第12-14天可以进行传代

结构复杂性：成熟的类器官应表现出与真实器官相似的分层或分区结构（如肠类器官的隐窝-绒毛结构、脑类器官的皮层样分层等）。

以上均可通过镜下观察进行判断。

2 细胞组成

细胞类型多样性：成熟的类器官应包含多种细胞类型，例如肠类器官中应包含肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞等。可通过免疫荧光染色或流式细胞术检测特定细胞标志物（如Lgr5+干细胞、MUC2+杯状细胞）来判断。

(A) 肠道类器官组织学H&E染色；(B)免疫组化显示肠组织中产生MUC2的杯状细胞（红色）

图片来源：doi:10.14573/altex.1908311s

细胞分化程度：成熟的类器官中细胞应完成分化，表达成熟细胞标志物（如肠类器官中的Villin、脑类器官中的NeuN等），可采用蛋白质免疫印迹（WB）检测其是否表达预期的Biomarker。

3 功能检测

分泌功能：检测类器官是否具有分泌功能（如肠类器官分泌黏液、胰腺类器官分泌胰岛素）。

电生理活性：对于神经类器官，可通过膜片钳等技术检测神经元的电生理活性。

代谢活性：检测类器官的代谢活性（如ATP生成、氧气消耗率）。

预期功能：检测其是否具有预期功能，例如肠类器官细胞 CFTR 活性功能检测、心脏类器官是否可以自主跳动等。

4 基因表达分析

qPCR或RNA测序：检测类器官中与成熟相关的基因表达水平（如肠类器官中的分化标志物、脑类器官中的神经元特异性基因）。

表观遗传状态：检测类器官的DNA甲基化或染色质状态，判断其是否接近体内成熟组织。

二. 类器官传代流程 

1 判断何时进行传代

类器官生长速率：当类器官直径达到200-500 μm时或类器官生长速度明显减慢时，通常需要传代。

培养基消耗：如果培养基变黄，说明需要传代。

类器官结构变化：如果类器官结构开始变得不规则或出现中心坏死，应尽快传代。

2 传代步骤

收集类器官：用移液器轻轻吹打培养基，将类器官从基质胶中释放出来。将类器官转移至离心管中。

消化类器官：加入适量的消化酶，轻轻吹打类器官，使其解离成小细胞团或单细胞。消化时间根据类器官类型和消化酶浓度调整，通常为5-15分钟。

终止消化：加入含血清的培养基终止消化反应。用移液器轻轻吹打，使细胞团分散均匀。

离心和重悬：以300-500 g离心5分钟，弃上清。用新鲜培养基重悬细胞团。

重新接种：将细胞团与基质胶混合，接种到预热的培养板中。待基质胶凝固后，加入类器官培养基。

培养：将培养板放回37°C、5% CO₂培养箱中继续培养。

注意事项：

1.消化时间控制：消化时间过长可能导致细胞损伤，过短可能导致类器官解离不完全。

2.基质胶品质：使用高品质的基质胶，确保其均匀分布。

3.培养基优化：根据类器官类型选择合适的培养基成分（如Wnt、R-spondin、EGF等生长因子），确保类器官能够正常分化。

4.污染防控：严格无菌操作，避免类器官污染。

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